民國103年5月號

滋陰補腎──六味地黃丸的研究新知

「六味地黃丸」是廣為一般人所熟知的補腎中藥名方，出自北宋醫家錢乙的《小兒藥證直訣》，是張仲景《金匱要略》的「金匱腎氣丸」去掉附子與桂枝二味藥的變化方，由三味補肝、腎、脾藥的熟地、山茱黃、山藥，以及三味瀉虛火濕濁藥的澤瀉、牡丹皮、茯苓所組成，具有肝腎同補、滋陰降火之功效，在臨床多用於頭暈耳鳴、腰膝酸軟、盜汗遺精、虚火上炎、骨蒸潮热等肝腎陰虛證。

由於現代科學化的研究，使得中藥複方的藥理機制得以科學化的方法闡釋，並能更加精準地應用於臨床，因此將最近相關之研究摘述如下，期能提供複方研究的新思維及方向：

1. 網絡藥理學研究：

中藥複方具有多種化學成分及其作用標的，因此不能個別以其中單一種成分來闡釋中藥複方的整體作用。Liang等人以整體性的網絡藥理學 (network pharmacology) 方法分析六味地黃丸之分子藥理機制，並對化學成分與療效特性進行組合性分析，同時也評估了六味地黃丸的化學成分及其作用標的之間的關聯性。結果Liang等人自六味地黃丸核心分子標的與藥理作用的生物程序網絡 (bioprocess network) 推測出可能的臨床適應症 (如下圖所示)，顯示網絡藥理學的方法能整體性、全面性地闡釋中藥複方的藥理機制，不失為一種有效的研究方法 [1]。

 

2. 腎陰虛證的臨床有效性研究：

Huang等人利用單人交叉臨床隨機對照試驗 [n-of-1 randomized controlled trials (RCTs) ] 評估六味地黃丸治療腎陰虛證之有效性，以患者本身 (within-patient) 、隨機、雙盲、交叉等比較方法分析六味地黃丸與安慰劑對腎陰虛證患者的療效。首先記錄個人完成試驗率 (completion rates)、回應率 (response rate) 以及 post-n-of-1 RCTs 結果，再檢測個人Likert量表與SF-36健康狀況量表 (SF-36 questionnaire) 的整組分數。

結果50位患者已康復，3位未完全康復，47位患者完成試驗，其中3位有反應，28位無反應，16位為可能有反應者，醫師與患者根據試驗結果決定服用六味地黃丸是否能有效改善腎陰虛證，3位有反應的患者持續服用六味地黃丸，28位無反應者停止服用六味地黃丸，可能有反應的16位患者中的7位無法明確決定是否有效，而其他9位患者持續服用六味地黃丸。在整組試驗中，六味地黃丸與安慰劑之間的個人Likert量表與SF-36健康狀況量表無統計學差異。

Huang等人由實驗結果推測應挑選經驗豐富之中醫師為實驗審查者，並維持單人交叉臨床隨機對照試驗同樣的給藥試驗條件，以及中藥成份能有足夠的生物半生期，能使實驗數據更具可信度 [2]。

3. 對高血壓大鼠的保護作用：

高血壓為一種慢性且與多種身體系統有關聯性的複雜疾病，治療的關鍵在於穩定血壓並減少其他的危險因子。Yang等人探討六味地黃丸對高鹽高脂飲食所致高血壓雄性Sprague-Dawley大鼠模型的作用，將大鼠隨機分為4組：正常飲食控制組、高鹽高脂飲食不給藥組、高鹽高脂飲食給Valsartan組 (13.33 mg/kg/day) 以及高鹽高脂飲食給六味地黃丸組 (8.13 g/kg/day)，連續給藥6週後，分析血漿生化指數、檢測腎臟組織學及其功能。

結果發現六味地黃丸能降低高血壓大鼠的主動脈血壓、禁食後血糖、胰島素、高密度脂蛋白 (high-density lipoprotein cholesterol，HDL-c)、基礎胰島素阻抗、血漿的血管加壓素 (angiotensin，Ang) II以及腎臟的腎素 (renin)，同時也能促進尿液中Na⁺的排出、減少K⁺的排泄與微白蛋白尿 (microalbuminuria，MAU)，並改善腎絲球入球小動脈及其他組織的功能。Yang等人總結以上推測六味地黃丸能藉由降低主動脈壓來改善高血壓大鼠的各種生化指數 [3]。

4. 對糖尿病大鼠的神經保護作用：

最近的研究顯示六味地黃丸對改善糖尿病併發症有助益，因此Liu等人探討了六味地黃丸對streptozotocin (STZ) 誘發大鼠糖尿病性腦病變 (diabetic encephalopathy，DE) 所致記憶及認知障礙的神經保護作用。

連續50日餵食雄性Sprague Dawley成年大鼠高糖高脂飲食，再給予腹腔注射40 mg/kg的STZ以誘導DE動物模型，之後連續30日每日1次分別給予DE大鼠口服1 g/kg與2 g/kg的六味地黃丸，接下來利用Morris水迷宮試驗評估DE大鼠的記憶及認知能力。

其檢測其海馬迴中膽鹼乙醯轉移酶 (choline acetyltransferase，ChAT)、乙醯膽鹼酯酶 (acetylcholinesterase，AChE)、Na⁺-K⁺-ATP酶、誘發型一氧化氮合成酶 (inducible nitric oxide synthase，iNOS) 與榖胱甘肽 (glutathione，GSH) 的活性及含量；以TUNEL染色、免疫組織化學與Congo red染色等方法觀察神經細胞凋亡情形、caspase-3蛋白、類胰島素生長因子 (insulin-like growth factors，IGF) -1與腦源性神經營養因子 (brain derived neurophic factor，BDNF) 等表現情形以及類澱粉蛋白β (amyloid β) 堆積的情形。

結果發現六味地黃丸組與對照組大鼠相比，能顯著減少逃出水迷宮的潜伏期並縮短逃出所需的路徑長度，同時增加在Morris水迷宮試驗中的目標象限與平台交叉所需的時間。

此外，六味地黃丸也能顯著降低禁食血糖的濃度，增加海馬迴中Na⁺-K⁺-ATP酶與ChAT的活性，提高GSH的濃度並降低AChE與iNOS的活性。而在TUNEL、Congo red染色及免疫組織化學觀測結果中顯示六味地黃丸能明顯提高DE大鼠海馬迴與大腦皮質中IGF-1與BDNF的表現，抑制神經細胞凋亡、caspase-3過度表現與Aβ的堆積。因此Liu等人由上述結果推論六味地黃丸對DE大鼠具有神經保護作用，對治療DE或許有所助益 [4]。

5. 評估代謝症候群患者服用六味地黃丸後的臨床症狀、生化學及代謝質體學等數據：

van Wietmarschen的研究團隊分析了代謝症候群患者服用六味地黃丸前與服用後4週、8週的症狀、臨床生化指數及血清代謝物等數據變化的情形。首先以非線性主成份分析 (Nonlinear Principal Component Analysis) 方法整合分析症狀、臨床生化指數及血清代謝物等3組數據，比較服用前與服用後4週、8週的相關係數結構，接下來利用狀態空間方格 (State Space Grid) 法研究個人臨床症狀變化數據的差異性。

結果發現六味地黃丸顯著改善了患者的潮热與自汗症狀，大多數的症狀在服用8週後與其他變異因子較無相關性，而患者的低密度脂蛋白 (LDL-C)、總膽固醇、收縮壓與腰圍尺寸則明顯降低，磷酯醯膽鹼 (phosphatidylcholines) 也有顯著減少，進而改善脂質的代謝。

此外，個人臨床症狀的差異性診斷結果顯示六味地黃丸可顯著改善陰虛，對兼有氣虛證的患者也能改善氣虛的情形。另一方面，相關係數結構變化數據顯示六味地黃丸治療後的症狀與代謝物之間的關聯性不大，推測治療後的健康狀況有改善。狀態空間方格法分析顯示六味地黃丸對於治療陰虛證與氣虛證的作用不同，六味地黃丸的滋陰作用確實減少了與陰虛有關的症狀。

因此van Wietmarschen的研究團隊認為六味地黃丸不論是用於治療陰虛證抑或氣虛證，皆須以因人而異的辯證施治法進行治療及評估療效，這正是發展個人化醫學的首要步驟 [5]。

6. 對不孕症婦女體外胚胎受精及卵巢濾泡液的影響：

連方等人探討六味地黃顆粒對腎陰虛證不孕症婦女前胚胎移植體外受精 (in vitro fertilization pre-embryo transfer，IVF-ET) 的作用及卵巢濾泡液的蛋白體表現情形的影響，以瞭解其機制。

將66名接受IVF-ET的腎陰虛證不孕症婦女隨機分為治療組及對照組，每組33人；另33名非腎陰虛證不孕症婦女則作為證型對照組。治療組除了西醫常規治療外，做IVF前連續3個月經週期給予六味地黃顆粒，對照組與證型對照組則相對連續3個月經週期給予安慰劑，並觀察各組腎陰虛證之症狀：腰膝痠軟、陰道乾澀、煩躁不安、五心煩熱等，所剩卵子數、較佳品質的卵子與胚胎之佔有率、受精率以及臨床受孕率，取出卵母細胞並收集卵巢濾泡液，以二維凝膠電泳 (two-dimensional gel electrophoresis)、基質輔助雷射脫附離子化飛行時間質譜 (matrix assisted laser desorption ionization time-of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS) 分析其蛋白質表現情形。

結果發現治療組的症狀評分顯著降低，且具有較多高品質的卵子與胚胎以及較高的臨床受孕率，但是對照組的症狀無顯著改變。在卵巢濾泡液的蛋白質表現情形方面，證型對照組與對照組相較，有33種蛋白質表現相異，其中18種表現減少，另15 種表現增加；治療組與對照組相較，有28種蛋白質表現相異，其中15種表現減少，另13種表現增加， MALDI-TOF-MS鑑定得到14種蛋白質。

連方等人認為六味地黃顆粒能改善接受IVF的不孕症患者的腎陰虛證，增加高品質的卵子與胚胎數量，提高受孕率，而此可能的機制為：藉由調控卵巢濾泡液蛋白質體表現，改善卵子成熟的微環境，提高胚胎植入的成功率 [6]。

7. 降低高脂飲食大鼠的體重與內臟脂肪的機制：

Nair的團隊針對六味地黃乙醇萃取物對有易胖體質的雄性CD大鼠的肥胖與相關代謝型態作用機制進行研究，給予大鼠餵食高脂飲食並分為：肥胖對照組、350 mg/kg六味地黃乙醇萃取物 (EE350) 組、700 mg/kg六味地黃乙醇萃取物 (EE700) 組，連續10週每日灌胃給藥。

結果發現連續3週給予EE700能降低大鼠體重，同時也能顯著減少內臟脂肪並降低血清總膽固醇、低密度脂蛋白、膽固醇、三酸甘油酯、游離脂肪酸以及瘦素 (leptin) 的濃度，而改善代謝型態。EE350則能降低皮下脂肪、血清總膽固醇、與游離脂肪酸，但對其他生化指數的影響則不明顯。六味地黃乙醇萃取物能隨劑量濃度升高而增加脂肪與碳水化合物的氧化、熱量消耗以及利用脂肪氧化產生熱量的效率。僅在給藥第5週時，EE350與EE700減低了大鼠食量，對每週總攝食量與整個10週的療程無明顯影響。

Nair的團隊根據實驗結果推測六味地黃乙醇萃取物有潛力開發成為預防肥胖的藥物，能提高熱量的代謝與消耗，並可能伴隨有降低熱量攝取的作用 [7]。

8. 對摘除卵巢大鼠骨質疏鬆症的影響及其可能的機制：

Xia的團隊觀察六味地黃複方對摘除卵巢大鼠骨質疏鬆症的影響，並探討了此複方對Wnt/β-catenin訊息路徑的影響。

將摘除卵巢的8週齡Sprague-Dawley (SD) 雌鼠連續12週胃內給予六味地黃複方，犧牲後檢測其血清中鹼性磷酸酶 (alkaline phosphatase，ALP)、骨鈣素 (osteocalcin，BGP) 與雌二醇 (estradiol，E2) 的濃度，觀察右股骨的骨礦物密度 (BMD) 與組織型態學，觀測脊椎的生物力學，並以RT-PCR分析Lrp-5、β-catenin、Runx2、Osx 等與Wnt/β-catenin訊息路徑相關的蛋白表現。

此外，另自新生大鼠頭蓋骨 (calvariae) 分離出造骨母細胞 (osteoblasts) 以進一步探究六味地黃複方對Wnt/β-catenin訊息路徑的影響。以MTT試驗、ALP活性與鈣化結節 (calcified nodules) 觀察骨細胞增殖及分化的情形，並分析骨細胞中Lrp-5、β-catenin、Runx2、Osx等mRNA的表現。

結果連續12週給予六味地黃複方能明顯減少血清中ALP與BGP的濃度、增加右股骨的BMD並改善脊椎生物力學的最大負重與彈性模量 (elastic modulus)。觀察組織型態學發現骨小樑略薄並呈現有順序的排列，右股骨 無明顯骨折。含六味地黃複方的血清能顯著增加造骨母細胞的存活率、ALP活性與鈣化結節量。另一方面，六味地黃複方於體內及體外實驗皆可明顯提升與Wnt/β-catenin訊息路徑有關的Lrp-5、β-catenin、Runx2、Osx蛋白表現。

Xia的團隊由上述結果推測六味地黃複方應該能改善摘除卵巢所致骨質疏鬆，其可能的機制為藉由增加造骨母細胞Wnt/β-catenin訊息路徑的表現而提升BMD，達到改善骨質疏鬆的作用 (圖示如下) [8]。

9. 改善巴金森氏症的可能機制：

神經退化性疾病巴金森氏症 (Parkinson's disease，PD) 的病徵為氧化壓力所致多巴胺黑質紋狀體神經元 (dopaminergic nigrostriatal neurons) 退化，因此Tseng的研究團隊想要瞭解六味地黃複方水萃取物對誘導巴金森氏症之毒性物質：1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP⁺) 與1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) 引起多巴胺神經退化的抗氧化機制，以加入MPP⁺培養初代中腦神經元 (mesencephalic neurons) 及給予MPTP的C57BL/6小鼠作為體內與體外實驗之模型，利用3D-HPLC分析化學成份與進行定量分析。

結果六味地黃複方水萃取物能減少MPP⁺誘發初代培養、酪胺酸羥化酶 (tyrosine hydroxylase，TH) 陽性中腦神經元消失的數量，同時增加Annexin V陽性的神經元。抗氧化機制研究結果顯示，六味地黃複方水萃取物能增加抗氧化物超氧歧化酶 (SOD) 與榖胱甘肽的含量，降低自由基生成與NADPH氧化酶 (Nox2與Nox4) 的表現，減少MPP⁺誘導的氧化傷害。

另一方面，六味地黃複方水萃取物能藉由改善粒線體膜電位、增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表現並抑制凋亡訊息傳遞分子Bax、細胞色素 (cytochrome) c與cleaved-caspase-3，而能減少MPP⁺誘發神經細胞凋亡的情形。體外動物模型實驗顯示：六味地黃複方水萃取物可抑制MPTP所致C57BL/6小鼠黑質緻密部 (substantia nigra pars compacta，SNpc) 的TH陽性神經元喪失，並改善小鼠的活動力。

Tseng等人歸納得到結論：六味地黃複方水萃取物經由提高抗氧化力與減少細胞凋亡而達到保護多巴胺神經元的作用，對PD的治療具有潛在的助益 [9]。

參考文獻

1. Liang, X., Li, H., Li, S. A novel network pharmacology approach to analyse traditional herbal formulae: the Liu-Wei-Di-Huang pill as a case study. Mol. Biosyst., 10:1014-1022, 2014.

2. Yuhong, H., Qian, L., Yu, L., Yingqiang, Z., Yanfen, L., Shujing, Y., Shufang, Q., Lanjun, S., Shuxuan, Z., Baohe, W. An n-of-1 trial service in clinical practice: testing the effectiveness of Liuwei Dihuang decoction for kidney-yin deficiency syndrome. Evid. Based Complement. Alternat. Med., 2013:827915, 2013.

3. Yang, Q., He, Y., Wang, W. The protective effect of Liu-Wei-Di-Huang-Fang in salt-sensitive hypertension rats. Clin. Exp. Hypertens., in press, 2013.

4. Liu, J.P., Feng, L., Zhang, M.H., Ma, D.Y., Wang, S.Y., Gu, J., Fu, Q., Qu, R., Ma, S.P. Neuroprotective effect of Liuwei Dihuang decoction on cognition deficits of diabetic encephalopathy in streptozotocin-induced diabetic rat. J. Ethnopharmacol., 150:371-381, 2013.

5. van Wietmarschen, H.A., van der Greef, J., Schroën, Y., Wang, M. Evaluation of symptom, clinical chemistry and metabolomics profiles during Rehmannia six formula (R6) treatment: an integrated and personalized data analysis approach. J. Ethnopharmacol., 150:851-859, 2013.

6. Lian, F., Wu, H.C., Sun, Z.G., Guo, Y., Shi, L., Xue, M.Y. Effects of Liuwei Dihuang Granule (六味地黄颗粒) on the outcomes of In Vitro fertilization pre-embryo transfer in infertility women with kidney-yin deficiency syndrome and the proteome expressions in the follicular fluid. Chin. J. Integr. Med., in press, 2014.

7. Nair, S.V., Zhang, J., Wang, Y. Ethanol extract of Liuwei Dihuang reduces weight gain and visceral fat in obese-prone CD rats fed a high-fat diet. Exp. Biol. Med. (Maywood), in press, 2014.

8. Xia, B., Xu, B., Sun, Y., Xiao, L., Pan, J., Jin, H., Tong, P. The effects of Liuwei Dihuang on canonical Wnt/β-catenin signaling pathway in osteoporosis. J. Ethnopharmacol., 153:133-141, 2014.

9. Tseng, Y.T., Chang, F.R., Lo, Y.C. The Chinese herbal formula Liuwei dihuang protects dopaminergic neurons against Parkinson's toxin through enhancing antioxidative defense and preventing apoptotic death. Phytomedicine, 21:724-733, 2014.