民國100年2月號

黃耆藥理成分研究新知

黃耆為豆科 (Leguminosae) 植物膜莢黃耆 (Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge) 或蒙古黃耆 (Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao) 之乾燥根，甘、溫，歸肺、脾經，主要功效為補中益氣、升陽固表 [1]，以現代科學分析技術已知具有：多醣類 (astragalan，黃耆多醣)、三萜皂苷類(astragalosides，皂苷)、黃酮類、胺基酸、酚酸、蔗糖、微量元素等成分 [2, 3]。

黃耆多醣A、B、C主要為葡聚糖 (glucans)，黃耆多醣D則為異質多醣 (heteropolysaccharide)，體內及體外實驗發現具有抗癌及增強免疫的作用 [4-6]；黃耆皂苷I-VII的結構為在配糖體環黃耆醇 (aglycone cycloastragenol) 3-, 6-, 25-的位置上接1至3個糖 [7, 8]，實驗發現具有抗發炎、降血壓、抗氧化等作用 [3, 9, 10]；黃耆黃酮類成分calycosin-7-O-β-D-glucoside, calycosin-7-O-β-D-glucoside-6'-O-malonate, ononin, (6aR,11aR)-3-hydroxy-9,10-dimethoxypterocarpan-3-O-β-D-glucoside, calycosin, (3R)-7,2'-dihydroxy-3',4'-dimethoxyisoflavan-7-O-β-D-glucoside, formononetin-7-O-β-D-glucoside-6'-O-malonate以及formononetin，具有抗氧化、免疫調節作用，能改善慢性疲勞症狀 [11]；其他成分尚有揮發油等 [12]。

由於黃耆的成分有諸多藥理作用，因此成為近來中藥研究的熱門題材，尤其是能夠減緩染色體端粒 (telomere) 縮短的速度而倍受矚目 [13]。茲綜述近期研究文獻，提供未來研究的新趨勢：

1. 加速傷口修復機制：

在補充與替代醫學裡常用formononetin來改善血液微循環， Huh等人以人類臍靜脈內皮細胞 (human umbilical vein endothelial cells，HUVECs) 來探討formononetin對傷口 (組織) 修復早期生長反應因子-1 (early growth response factor-1，Egr-1) 與生長因子 (growth factors) 表現的影響。結果formononetin能顯著增加轉化生長因子-β1 (transforming growth factor-beta 1，TGF-β1) 、血管內皮生長因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF) 、血小板衍生生長因子 (platelet-derived growth factor，PDGF) 以及鹼性纖維母細胞生長因子 (basic fibroblast growth factor，bFGF) 等生長因子的表現，同時也能增加Egr-1轉錄因子的表現量，增加內皮細胞增生與填補因受傷而流失的HUVECs。

血管新生體外實驗結果發現，formononetin較VEGF125所促進的微血管增生面積更大，HUVECs細胞的增殖與遷徙情形亦較多。西方墨點法分析刮除誘導傷口癒合處所聚集的HUVECs，顯示formononetin能誘導細胞外訊息調控激酶 (extracellular signal-regulated kinase，ERK) 磷酸化以及輕微抑制p38絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase MAPK) 磷酸化，而ERK抑制劑PD98059與p38抑制劑SB203580能抑制以formononetin為媒介所導致的Egr-1持續活化，同時PD98059能抑制formononetin誘導內皮細胞增殖及修復傷口的HUVECs，而SB203580能增加細胞的增殖與傷口癒合。此外，formononetin能加速手術後第3日至第10日受傷動物模型傷口結痂速度。由以上實驗結果推測formononetin能藉由調控ERK1/2與p38 MAPK訊息傳導路徑，使Egr-1轉錄因子過度表現而達到促進內皮修復與傷口癒合的功效 [14]。

2. 免疫調節作用：

最近有報導指出黃耆注射液 (Astragalus membranaceus injection，AMI) 有抑制免疫反應的作用，但對於同種異體移植 (allograft) 免疫反應影響的相關研究較少，因此Qu等人想要探討AMI對同種異體移植模型鼠的存活時間以及能降低免疫反應的CD4+ CD25+ regulatory T 細胞 (Treg) 的影響。異體移植模型鼠分為AMI組、環孢靈素 (cyclosporine) 組與對照組，連續14天給藥，觀察其存活時間；分別以混合淋巴細胞反應 (mixed lymphocyte reactions，MLR) 與免疫螢光染色、螢光顯微鏡觀察Treg比率，反轉錄酶-聚合酶鍊反應 (reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR) 觀察Foxp3 mRNA的表現，放射免疫分析 (radioimmunoassay) 觀察介白素 (interleukin，IL) -10的分泌情形。

結果AMI能藉由提升Treg的比率與促進Foxp3的表現 (P <0.05) 顯著延長異體移植模型鼠的存活時間，且給予AMI的模型鼠其Treg的比率、Foxp3 mRNA的表現以及IL-10的濃度自給藥後第7日逐漸增加至第14日達到最大濃度，第21日則恢復至初始濃度，而AMI組與環孢靈素組並無顯著差異。由上述結果推測AMI藉由促進Treg活化而能夠延長異體移植模型鼠的存活時間 [15]。

已有研究證實黃耆95 % 乙醇萃取物結合多種形式的疫苗具有免疫佐劑 (adjuvant) 的活性，因此Hong等人想要鑑定此萃取物中具有免疫佐劑活性的成份。以結合癌糖抗原 (cancer carbohydrate antigens) globo H及GD3的keyhole limpet hemocyanin (KLH)、結合黃耆不同成分萃取物或購置的黃耆皂苷與黃酮類的癌胜肽抗原 (cancer peptide antigen) MUC1使小鼠免疫，酶連免疫吸附法 (enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA) 分析抗體對癌抗原與KLH的反應，計算小鼠減少的體重以評估毒性反應。

結果黃耆皂苷II與IV為萃取物中的主要成分，但2者毒性差異甚遠：黃耆皂苷II為毒性最強的成分，500 µg劑量即能使小鼠體重減少5-10 %，而同劑量的黃耆皂苷IV則對體重無影響，顯示黃耆皂苷IV可能為較佳的免疫佐劑，而一些黃酮類亦具有明顯的佐劑活性。依據這些已知成分在黃耆95 % 乙醇萃取物中所佔比例，計算免疫活性的強弱，結果他們僅有少部分的免疫活性，可能尚有其他成分具有免疫佐劑活性，或黃耆所有成分具有協同作用，較單一成分的免疫佐劑活性強 [16]。

3. 改善糖尿病腎病變：

黃耆對糖尿病腎病變 (diabetic nephropathy，DN) 具有腎臟保護作用，為了評估它的治療作用，Li等人系統性地評核了有顯著意義的隨機對照研究 (randomized control trials，RCT) 與半隨機對照研究 (semi-randomized control trials，CCT) 。以電腦及人工搜尋PUBMED、MEDLINE、中國期刊全文資料庫 (Chinese journal full-text database，CJFD) 、中國生物醫學文獻數據庫 (Chinese biomedical literature database，CBM) 到25篇研究，包含21篇RCTs及4篇CCTs，每篇研究由2位評核者各自獨立評估，總計1804位DN病患 (治療組945位病患，對照組859位病患) 。結果與對照組比較，黃耆注射液組對DN病患的腎臟保護作用 [評估血液尿素氮 (blood urea nitrogen，BUN) 、血清肌酸酐 (serum creatinine，SCr) 、肌酸酐廓清率 (creatinine clearance，CCr) 與尿蛋白等生化指標] 與全身狀況改善 [評估血清白蛋白濃度 (serum albumin level) ] 有較佳的療效，有助於瞭解黃耆對DN的治療作用 [17]。

4. 抗癌作用：

Auyeung等人過去研究發現黃耆總皂苷 (total saponins of Astragalus membranaceus，AST) 對人類大腸癌細胞與異種異體移植 (xenograft) 腫瘤具有抑制生長的作用，為了要更進一步瞭解其機制，Auyeung等人繼續探討了AST誘導人類大腸癌HT-29細胞凋亡前的作用。AST (60 μg/ml) 對未加任何影響因子的HT-29細胞與加入5 ng/ml腫瘤壞死因子 (tumor necrosis factor，TNF) 誘導的HT-29細胞均有抑制生長的作用，但對TNF誘導的細胞抑制效果極為顯著，主要是因為caspase 3與poly (ADP-ribose) 聚合酶的切割 (cleavage) 而增加了凋亡細胞數量。procaspase 8的活化顯示啟動了外源性凋亡訊息傳遞路徑，而Bid 切割成t-Bid則顯示與內源性凋亡訊息傳遞路徑有交互影響。

此外，AST導致細胞週期停滯於S與G2/M期，而加入細胞激素誘導的細胞週期會顯著停滯於S期，主要機制為AST能活化磷脂醯肌醇3-激酶 (phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K) -Akt訊息傳遞，導致PTEN的過度表現並降低哺乳動物雷帕黴素標靶 (mammalian target of rapamycin，mTOR) 的表現，因而降低核因子-κB (nuclear factor-kappaB，NF-κB) /DNA binding訊息傳遞路徑的活化以及ERK 1/2的活化，此作用於細胞激素誘導的細胞更為明顯。由上述實驗結果顯示AST能誘導外源性細胞凋亡訊息傳遞，調控mTOR與ERK訊息傳遞以抑制NF-κB的訊息傳遞而導致HT-29細胞之細胞週期停滯，上述這些作用在細胞激素誘導的細胞表現更為顯著 [18]。

直腸結腸癌是最常見的消化道腫瘤之一，向開敏等人觀察了黃耆皂苷對二甲肼 (1,2-dimethylhydrazine，DMH) 誘導大鼠直腸結腸異性隱窩灶 (aberrant crypt foci，ACF) 癌前病變、肝臟微粒體細胞色素P450 (cytochrome P450，CYP450) 含量以及穀胱甘肽轉移酶 (glutathione-S-transferase，GST) 活性的影響，同時初步探討其作用機制。40隻雄性Sprague-Dawley (SD) 大鼠隨機均分為：空白對照組、黃耆皂苷組、DMH組、黃耆皂苷+DMH組，連續8周腹腔注射DMH誘發直腸結腸癌，第9周至第12周腹腔注射黃耆皂甙溶液，之後將大鼠脫頸犧牲，取直腸結腸和肝組織，以甲基藍 (methylene blue) 染色，觀察並計算ACF的數量，分速離心法 (differential centrifugation) 分離大鼠肝組織的微粒體 (microsomes) ，一氧化碳還原分離光譜 (differential spectrometry) 測定CYP450酵素總含量，分光光度計 (spectrophotometry) 檢測穀胱甘肽的濃度，以得知GST活性大小。

結果黃耆皂苷+DMH組大鼠的ACF和大型ACF數量較DMH組顯著下降 (P<0.05) ，DMH組與空白對照組、黃耆皂苷組、黃耆皂苷+DMH組比較，CYP450酵素含量顯著上升，GST活性顯著下降 (P<0.05) ，顯示黃耆皂苷可能藉由降低肝臟微粒體CYP450酵素含量，提升GST活性而減少二甲肼誘導大鼠結腸直腸產生異性隱窩灶的數量 [19]。

5. 輻射防護作用：

Li等人想要比較紅景天苷 (rhodioside)、刺五加皂苷-B (ciwujianoside-B) 以及黃耆皂苷IV等3種糖苷對暴露在γ射線光下之小鼠造血系統的輻射防護作用，並探討其可能機制。BALB/cAnN雄性小鼠隨機分為5組：空白對照組 (給予生理食鹽水) 、輻射組 (γ射線處理) 、紅景天苷組、刺五加皂苷-B組與黃耆皂苷IV組，3種糖苷組每日分別灌胃給予40 mg/kg糖苷，連續7日後全身照射γ射線 (6.0 Gy)，並觀察小鼠存活情形。計算周邊血液白血球與内源性脾臟群落 (endogenous spleen colony) 數量、分析顆粒球-巨噬細胞群落形成單位 (colony-forming unit-granulocyte macrophage，CFU-GM) 、DNA含量與細胞凋亡率，以評估3種糖苷對輻射傷害後造血作用的影響；慧星試驗 (comet assay) 觀察淋巴球DNA碎裂情形，流式細胞儀 (flow cytometry) 觀察細胞週期的變化，西方墨點法 (western blot) 與凝膠電泳遷移率改變分析 (electrophoretic mobility shift assay) 觀察Bcl-2、Bax與NF-κB的表現水平。

結果3種糖苷組小鼠存活時間延長，白血球、脾臟群落與顆粒球-巨噬細胞群落數量增加，且3種糖苷均能顯著增加骨髓細胞增殖並降低G0/G1期的細胞比率，減少DNA損傷程度與輻射所致Bax/Bcl-2增加的比率，但紅景天苷的保護效用較刺五加皂苷-B與黃耆皂苷IV強。綜合以上實驗結果，3種糖苷對小鼠的造血系統均具有輻射防護作用，主要機制可能為改變細胞週期、減少骨髓細胞因輻射所引起的DNA損傷與降低Bax/Bcl-2的比率 [20]。

6. 預防氣喘：

Yuan等人探討了黃耆皂苷IV對預防氣喘的功效與機制，連續12週每2週2次以卵白蛋白 (ovalbumin，OVA) 致敏小鼠，造成慢性氣喘動物模型，之後連續4週給予黃耆皂苷IV，觀察發炎反應相關細胞數量、細胞激素IL-4與IFN-γ的濃度、氣管壁膠原蛋白沉積與黏液素 (mucin) 生成的情形。給予黃耆皂苷IV後，結果支氣管肺泡灌洗液 (bronchoalveolar lavage fluid，BALF) 中發炎反應相關細胞 [嗜伊紅性白血球 (eosinophils)、嗜中性球 (neutrophils)、淋巴球 (lymphocytes) 等] 數量顯著減少，IFN-γ的濃度顯著增加，氣管壁膠原蛋白沉積與黏液素 (mucin) 生成減少，緩解了氣道過敏反應。由以上結果推測黃耆皂苷IV能減緩慢性氣喘的發展，對慢性氣喘的患者可能具有輔助治療的效果 [21]。

7. 藥物代謝動力學：

最近有研究發現黃耆皂苷IV配糖體衍生物環黃耆醇（cycloastragenol，CAG）能活化端粒酶（telomerase），具有開發成為治療退化性疾病的潛力，因此Zhu等人分別以Caco-2腸細胞模型與肝臟微粒體探討CAG的腸道吸收與代謝情形。結果CAG能迅速被動擴散穿透Caco-2單層細胞，Caco-2單層細胞頂端與基底側發現了4種不同的glucuronide結合物與2種氧化的CAG代謝物，顯示CAG的首渡腸代謝（first-pass intestinal metabolism）主要發生於腸上皮通道。CAG 經由大鼠與人類肝臟微粒體代謝30分鐘後，分別僅存初始量的17.4% 及8.2%，並發現肝臟組織有單羥基化（monohydroxylation）的CAG與羥基化的CAG氧化的現象。由上述結果推知CAG 能有效地經由腸上皮吸收，但強力的首渡肝臟代謝可能會限制口服的生物利用性 [22]。

8. 生物轉化：

由於真菌Cunninghamella species具有類似哺乳動物肝臟的微粒體單氧酶系統（microsomal monooxygenase system），Kuban等人研究環黃耆醇經由Cunninghamella blakesleeana NRRL 1369特殊的微生物轉化（microbial transformation）作用，並以1-D（1H, 13C）與2-D NMR（COSY, HMBC, HMQC, NOESY）及質譜儀分析發現，9,19-cyclopropane環切割且甲基移動而產生C9-C10雙鍵，使得所生成的代謝物產生三萜骨架（如下圖所示），再一次證實了C. blakesleeana發展成為生物活性分子轉化系統的潛能，而環黃耆醇這類含量少、生物利用率較低的分子，經由微生物轉化後的分子也許能提高活性與產量，對於後續研究裨益良多 [23]。

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