藁本內酯（Ligustilide）的藥理研究新知
民國100年7月號
藁本內酯 (Ligustilide) 的藥理研究新知
藁本內酯 (Ligustilide) 為中藥當歸 (Angelica sinensis (Oliv.) Diels) 之指標成份 [1]，屬於苯酞 (phthalide) 類化合物 [2, 3]，首次自繖形科 (Umbelliferae) 藁本屬植物Ligusticum acutilobum中分離得到，並命名為ligustilide，為淡黃色帶香味的油狀液體，可分為Z-ligustilide與E-ligustilide順反兩種異構體，而以Z型較穩定而含量居多。為存在於當歸、川芎、藁本之揮發油中的親脂性成份，可溶於乙醇、甲醇、乙醚、乙酸乙酯、石油醚等有機溶劑，分子式為C12H14O2 [4]，其藥理作用的相關研究包括：抗發炎 [5, 6]、抗血小板聚集 [7]、抗癌 [8]、神經保護作用 [9-12]、鎮痛 [13]、血管舒張作用 [14-16]、抑制血管平滑肌增生 [17, 18]、抗菌 [19, 20]、抗子宮痙攣 [21] 等。
由於藁本内酯的穩定性較低，多數研究著重於分離、純化及鑑定，藥理方面的研究進行不易，茲將近期研究文獻精華扼要地歸納簡述如下：
1. 抗發炎活性：
藁本内酯為當歸 (Angelica sinensis，AS) 主要成份，含量甚豐，Su等人研究了藁本内酯對脂多醣 (lipopolysaccharide，LPS) 誘導RAW 264.7 巨噬細胞所產生之發炎反應的影響。實驗結果發現：藁本内酯能顯著抑制LPS誘導RAW 264.7 巨噬細胞生成一氧化氮 (nitric oxide，NO)、前列腺素E2 (E2，PGE2) 以及腫瘤壞死因子 (tumor necrosis factor-α，TNF-α)，對NO的抑制作用也伴隨著降低誘發型一氧化氮合成酶 (induced nitric oxide synthase，iNOS) 蛋白質與mRNA 含量。
另一方面，藁本内酯也遏止了細胞核中活化子蛋白-1 (activator protein-1，AP-1) 與核因子-κB (nuclear factor κB，NF-κB) 的活化，以及細胞質中IκBα的降解 (degradation) ，並抑制IκB激酶 (IκB kinase，IKK) 與絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinases，MAPKs)，包括：p38 MAPK、細胞外訊息調控激酶 (extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2) 與c-Jun N端激酶 (c-Jun N-terminal kinase，JNK) 等之磷酸化，細胞內活性氧 (intracellular reactive oxygen species，iROS) 含量也顯著下降。由上述結果推測藁本内酯具有抗發炎活性，可能機制為藁本内酯減少iROS生成，因而阻斷MAPKs/IKK以及下游轉錄因子AP-1與NF-κB的活化 [22]。
中風為世界常見第三大死因，最近研究發現許多嚴重的腦血管疾病，例如：缺血性中風，與神經細胞發炎反應有關；而在缺血期間，微神經膠細胞 (microglia) 製造發炎介質TNF-α與NO，為致病之關鍵。
中醫常使用川芎 (Ligusticum chuanxiong，LCX) 來治療腦血管疾病與心血管疾病，Or等人應用生物活性指標分離法 (bioactivity-guided fractionation scheme) 將LCX中2種抑制神經發炎的方法分離出來，以色層分析與光譜鑑定為川芎内酯 (senkyunolide) A與Z-藁本内酯，能抑制受LPS刺激的鼠BV-2微神經膠細胞與人類周邊血液單核球活化後的巨噬細胞製造發炎前介質，並能保護Neuro-2a細胞免受LPS刺激的鼠BV-2細胞培養液所致神經發炎毒性。川芎内酯A的抗發炎機制則不同於Z-藁本内酯，與MAPK磷酸化、NF-κB轉位 (translocation) 無關，且川芎内酯A還能增加TNF-α mRNA的降解，並減少它的半生期達43%。
綜合以上所述，以生物活性為指標的分離法能有效分離出藥用植物的活性成分，且自LCX分離出來的川芎内酯A與Z-藁本内酯有發展成為替代治療腦血管疾病的抗發炎藥物之潛力 [23]。
2. 神經保護作用：
王雁南等人研究了藁本內酯對缺血-再灌注 (ischemia-reperfusion，I/R) 局部性腦損傷SD大鼠模型的神經保護作用及其對發炎因子的調控。以局部腦血流監測，建立大腦中動脈阻塞/再灌注 (middle cerebral artery occlusion /reperfusion，MCAO/R) 大鼠模型，並隨機分為假手術組、溶媒對照組以及藥物治療組；除假手術組外，其餘於再灌注後0、3 h腹腔分別注射3% Tween 80溶媒、20 mg/kg藁本內酯。實驗過程中持續監測腦局部血流的下降和再灌注情況，缺血2 h與再灌注24 h後進行Menzies SA神經功能評分，並以TTC染色觀察腦組織梗塞體積。藥物治療組給藥後24 h，免疫組織化學染色分析大鼠腦組織，觀察藁本內酯對發炎因子NF-κB的影響。
結果藁本內酯能明顯改善MCAO/R大鼠神經功能 (P<0.01) ，且藥物治療組腦梗塞體積顯著小於溶媒組 (P<0.01)，發炎因子NF-κB的蛋白表現量明顯減少 (P<0.01)。由上述實驗結果推測，藁本內酯能降低發炎因子NF-κB的表現，對於MCAO/R大鼠腦損傷具有顯著的保護作用 [24]。
過去研究指出藁本內酯 (Z-Ligustilide，LIG) 具有保護腦缺血損傷的作用，然而其機制並未被深入研究，因此Wu等人探討了紅血球生成素 (erythropoietin，EPO) 與RTP801在LIG對缺血-再灌注 (I/R) 損傷的神經保護作用中，所扮演的角色。以大腦中動脈阻塞大鼠模型，分析體內神經功能、腦梗塞體積與體外神經元存活率，評估LIG對I/R損傷的效果；西方墨點法 (Western blot) 分析EPO與RT801的表現情形；將RT801表現質體轉染 (transfection) 至SH-SY5Y神經細胞，分析其所造成的影響。
實驗結果發現：體內實驗發現LIG能顯著降低I/R鼠腦神經功能不足之分數、減少腦梗塞體積與RT801的表現，並增加EPO的轉錄；體外實驗發現LIG能顯著增加I/R神經元存活率與EPO濃度，降低LDH與RTP801的表現。另一方面，LIG能增加磷酸化的ERK (p-extracellular signal-regulated kinase，p-ERK) ，而LIG對p-ERK、神經元存活率與EPO的增加效用能顯著被PD98059阻斷，LY294002與SB203580則無影響。
此外，將RT801表現質體轉染至SH-SY5Y神經細胞能顯著增加RT801的表現與LDH的釋放，而LIG則能顯著抑制因質體轉染而過度表現的RT801，同時提升細胞存活率。由上述結果推測LIG對I/R損傷具有顯著的神經保護作用，可能的機制為藉由活化ERK訊息路徑與抑制RTP801的表現而促進EPO轉錄，未來有可能研發成為預防缺血性神經疾患的治療藥物 [25]。
蛛網膜下腔出血 (Subarachnoid hemorrhage，SAH) 是一種破壞性極強又罕見的中風類型，但SAH的致死率仍占了所有中風類型的25%。儘管有各種預防及治療SAH的神經保護措施，但大多數SAH患者仍然必須經歷初級出血與 (或) 次級腦損傷所致嚴重的神經與 (或) 認知損傷。
藁本內酯 (Z-Ligustilide，LIG) 在過去的研究顯示具有減少腦缺血損傷的作用，而主要的機制為活化抗凋亡訊息路徑，因此Chen等人研究了LIG對實驗性SAH大鼠的神經保護作用。以雙出血 (double hemorrhage) 建立SAH大鼠模型，分別不給或給予LIG，觀察第3日與第7日大鼠的死亡率、神經行為評估、腦水含量、血腦障壁 (blood brain barrier，BBB) 通透性與基底動脈血管痙攣等情形；此外也以TUNEL 染色、免疫組織化學法、西方墨點法以鑑定凋亡前驅與殘存主要蛋白，例如：p53、Bax、 Bcl-2與cleaved caspase-3。
結果顯示服用LIG的大鼠能降低死亡率、神經行為缺陷、腦水腫、BBB 通透性與大腦血管痙攣，並減少腦損傷周圍凋亡細胞數目，顯著降低凋亡前驅蛋白p53與cleaved caspase-3。由上述實驗結果推測LIG可能藉由抗凋亡的機制達到有效緩解SAH所致腦損傷的效用 [26]。
3. 炮製對藥理作用的影響：
當歸 (Angelica Sinensis Radix，ASR) 經酒炙法處理之後，能增強其生物活性，因此Zhan等人以正交法 (orthogonal array) 評估了ASR酒炙過程中的爐溫 (oven temperature)、烘乾時間 (baking time) 與翻轉頻率 (flipping frequency)，以瞭解其化學成分與藥理活性之變化。
實驗結果發現爐溫與烘乾時間為主要影響因子，而翻轉頻率則為次要因子，得到最佳酒炙條件為爐溫80°C烘乾90 min，每小時翻轉2次，而ASR的阿魏酸 (ferulic acid) 的溶解度顯著增加，Z-藁本內酯的溶解度顯著降低。此外，酒炙ASR抗血小板聚集與類雌激素等藥理活性增強，可能與阿魏酸及Z-藁本內酯溶解度改變有關，顯示酒炙ASR經化學與生物活性評估能印證炮製後中藥藥理活性的改變 [27]。
參考文獻
1. 劉崇喜，中草藥標準品 (Ferulic Acid、Ligustilide) 之研究與開發及檢驗技術之研究 (二) ，中醫藥年報，26:359-426, 2008。
2. Kobayashi, M., Fujita, M., Mitsuhashi, H. Components of Cnidium officinale Makino: occurrence of pregnenolone, coniferyl ferulate, and hydroxyphthalides. Chem. Pharm. Bull. (Tokyo), 32:3770-3773,1984.
3. Yi, L., Liang, Y., Wu, H., Yuan, D. The analysis of Radix Angelicae Sinensis (Danggui). J. Chromatogr. A, 1216:1991-2001, 2009.
4. 汪程遠、杜俊蓉、錢忠明，藁本內酯的研究進展，中國藥學雜誌，41:889-891，2006。
5. Kuang, X., Du, J.R., Chen, Y.S., Wang, J., Wang, Y.N. Protective effect of Z-ligustilide against amyloid beta-induced neurotoxicity is associated with decreased pro-inflammatory markers in rat brains. Pharmacol. Biochem. Behav., 92:635-641, 2009.
6. Wang, J., Du, J.R., Wang, Y., Kuang, X., Wang, C.Y. Z-ligustilide attenuates lipopolysaccharide-induced proinflammatory response via inhibiting NF-kappaB pathway in primary rat microglia. Acta Pharmacol. Sin., 31:791-797, 2010.
7. Zhang, L., Du, J.R., Wang, J., Yu, D.K., Chen, Y.S., He, Y., Wang, C.Y. Z-ligustilide extracted from Radix Angelica Sinensis decreased platelet aggregation induced by ADP ex vivo and arterio-venous shunt thrombosis in vivo in rats. Yakugaku Zasshi, 129:855-859, 2009.
8. Kan, W.L., Cho, C.H., Rudd, J.A., Lin, G. Study of the anti-proliferative effects and synergy of phthalides from Angelica sinensis on colon cancer cells. J. Ethnopharmacol., 120:36-43, 2008.
9. Kuang, X., Du, J.R., Liu, Y.X., Zhang, G.Y., Peng, H.Y. Postischemic administration of Z-Ligustilide ameliorates cognitive dysfunction and brain damage induced by permanent forebrain ischemia in rats. Pharmacol. Biochem. Behav., 88:213-221, 2008.
10. Yu, Y., Du, J.R., Wang, C.Y., Qian, Z.M. Protection against hydrogen peroxide-induced injury by Z-ligustilide in PC12 cells. Exp. Brain Res., 184:307-312, 2008.
11. Peng, H.Y., Du, J.R., Zhang, G.Y., Kuang, X., Liu, Y.X., Qian, Z.M., Wang, C.Y. Neuroprotective effect of Z-ligustilide against permanent focal ischemic damage in rats. Biol. Pharm. Bull., 30:309-312, 2007.
12. Kuang, X., Yao, Y., Du, J.R., Liu, Y.X., Wang, C.Y., Qian, Z.M. Neuroprotective role of Z-ligustilide against forebrain ischemic injury in ICR mice. Brain Res., 1102:145-153, 2006.
13. Du, J., Yu, Y., Ke, Y., Wang, C., Zhu, L., Qian, Z.M. Ligustilide attenuates pain behavior induced by acetic acid or formalin. J. Ethnopharmacol., 112:211-214, 2007.
14. Chan, S.S., Cheng, T.Y., Lin, G. Relaxation effects of ligustilide and senkyunolide A, two main constituents of Ligusticum chuanxiong, in rat isolated aorta. J. Ethnopharmacol., 111:677-680, 2007.
15. Cao, Y.X., Zhang, W., He, J.Y., He, L.C., Xu, C.B. Ligustilide induces vasodilatation via inhibiting voltage dependent calcium channel and receptor-mediated Ca2+ influx and release. Vascul. Pharmacol., 45:171-176, 2006.
16. Liang, M.J., He, L.C., Yang, G.D. Screening, analysis and in vitro vasodilatation of effective components from Ligusticum Chuanxiong. Life Sci., 78:128-133, 2005.
17. Lu, Q., Qiu, T.Q., Yang, H. Ligustilide inhibits vascular smooth muscle cells proliferation. Eur. J. Pharmacol., 542:136-140, 2006.
18. Liang, M.J., He, L.C. Inhibitory effects of ligustilide and butylidenephthalide on bFGF-stimulated proliferation of rat smooth muscle cells. Yao Xue Xue Bao, 41:161-165, 2006.
19. Chou, S.C., Everngam, M.C., Sturtz, G., Beck, J.J. Antibacterial activity of components from Lomatium californicum. Phytother. Res., 20:153-156, 2006.
20. Meepagala, K.M., Sturtz, G., Wedge, D.E., Schrader, K.K., Duke, S.O. Phytotoxic and antifungal compounds from two Apiaceae species, Lomatium californicum and Ligusticum hultenii, rich sources of Z-ligustilide and apiol, respectively. J. Chem. Ecol., 31:1567-1578, 2005.
21. Du, J., Bai, B., Kuang, X., Yu, Y., Wang, C., Ke, Y., Xu, Y., Tzang, A.H., Qian, Z.M. Ligustilide inhibits spontaneous and agonists- or K+ depolarization-induced contraction of rat uterus. J. Ethnopharmacol., 108:54-58, 2006.
22. Su, Y.W., Chiou, W.F., Chao, S.H., Lee, M.H., Chen, C.C., Tsai, Y.C. Ligustilide prevents LPS-induced iNOS expression in RAW 264.7 macrophages by preventing ROS production and down-regulating the MAPK, NF-κB and AP-1 signaling pathways. Int. Immunopharmacol., in press, 2011.
23. Or, T.C., Yang, C.L., Law, A.H., Li, J.C., Lau, A.S. Isolation and identification of anti-inflammatory constituents from Ligusticum chuanxiong and their underlying mechanisms of action on microglia. Neuropharmacology, 60:823-831, 2011.
24. 王雁南、杜俊蓉，藁本內酯對腦缺血再灌注大鼠的作用及其抗炎機制的研究，華西藥學雜誌，25:685-687。
25. Wu, X.M., Qian, Z.M., Zhu, L., Du, F., Yung, W.H., Gong, Q., Ke, Y. Neuroprotective effect of ligustilide against ischemia-reperfusion injury via up-regulation of erythropoietin and down-regulation of RTP801. Br. J. Pharmacol., in press, 2011.
26. Chen, D., Tang, J., Khatibi, N.H., Zhu, M., Li, Y., Wang, C., Jiang, R., Tu, L., Wang, S. Treatment with Z-ligustilide, a component of Angelica sinensis, reduces brain injury following a subarachnoid hemorrhage in rats. J. Pharmacol. Exp. Ther., in press, 2011.
27. Zhan, J.Y., Zheng, K.Y., Zhu, K.Y., Bi, C.W., Zhang, W.L., Du, C.Y., Fu, Q., Dong, T.T., Choi, R.C., Tsim, K.W., Lau, D.T. Chemical and biological assessment of Angelicae Sinensis Radix after processing with wine: an orthogonal array design to reveal the optimized conditions. J. Agric. Food Chem., in press, 2011.
