牛膝的藥理研究新知
民國100年9月號
牛膝的藥理研究新知
中藥牛膝為莧科 (Amaranthaceae) 牛膝屬 (Achyranthes) 植物牛膝 (Achyranthes bidentata Blume) 的乾燥根，又名「懷牛膝」，台灣市場曾與川牛膝 (Cyathula officinalis Kuan) 及腺毛馬藍 (Strobilanthes forrestii Diels) 植物的乾燥根發生誤用、混用的情形 [1-2]。這三種藥材的本草考證、植物形態、組織學檢查、化學成分、藥理作用及臨床功效皆不盡相同，因此在中醫藥委員會編輯之《台灣市售中藥材真偽及代用品圖集》及其中醫藥資訊網之常誤用藥材網頁中皆有相關記載以供中藥商及民眾鑑別。
《神農本草經》將牛膝列為上品，而「懷牛膝」之名首次出現於明代方賢的《奇效良方》。自魏晉時期《名醫別錄》、宋《圖經本草》與《證類本草》、明《救荒本草》與《本草綱目》、清《植物名實圖考》等對牛膝原植物形態的記述，皆顯示河南懷州所產之懷牛膝正是歷代沿用最久的牛膝。其主要功效為：滋補肝腎、強筋健骨、活血通經。川牛膝首見於唐代藺道人的《仙授理傷續斷秘方》，其後宋代楊士瀛《直指方》亦有記載。明代蘭茂的《滇南本草》及繆希雍的《神農本草經疏》對川牛膝的功效及產地有更多論述，並提出以四川產者為最佳。而後世文獻記載以四川天全縣產者為最佳，所以又名「天全牛膝」。其主要功效為：逐瘀通經、通利關節、利尿通淋。味牛膝於歷代本草典籍甚少提及，《中藥志》 (西元1959年) 中曾有記載。其主要功效為：活血散瘀、消腫止痛 [3]。
過去研究發現懷牛膝具有保肝降酶、鎮痛、利膽、抗衰老 [4]、防止動脈硬化 [5]、抑制蝕骨細胞 (osteoclast) 形成 [6] 及防止骨質流失 [7]、抗發炎 [8]、免疫佐劑效應 [9]、抑制腫瘤生長 [10]、修復神經 [11] 及神經保護 [12-15]、抗人類免疫缺陷病毒 (human immunodeficiency virus, HIV) [16]、增強免疫功能 [17]等作用。而本文主要探討的重點為上述三種牛膝最近的藥理研究文獻，並將其精華摘要論述如下：
1. 神經保護作用：
Shen等人過去研究懷牛膝 (Achyranthes bidentata Blume) 發現其水萃取物主要成份牛膝多肽 (Achyranthes bidentata polypeptides，ABPP) 具有神經保護作用。而這群研究團隊繼續以HPLC分離ABPP主要分離物ABPP-E4，探討ABPP-E4的神經保護機制。以ABPP-E4預處理血清抽離培養的SH-SY5Y神經細胞，評估細胞存活、凋亡情形及Bcl-2/Bax表現比率、caspase-3活化等情形。結果ABPP-E4能劑量相關性地抑制細胞凋亡，增加Bcl-2/Bax表現比率並抑制caspase-3的活化。訊息傳遞路徑分析結果發現，ABPP-E4能刺激血清抽離培養的SH-SY5Y神經細胞Akt/Gsk3β訊息傳遞路徑的活化，而ABPP-E4 的抗凋亡作用能被PI3K抑制劑所阻斷。依據上述實驗結果，Shen等人推論ABPP-E4可能藉由調控PI3K/Akt/Gsk3β訊息路徑而達到對血清抽離所致神經細胞凋亡的保護作用 [18]。
王麗君等人評估了懷牛膝總皂苷 (saponins from Achyranthes bidentata Blume，SAB) 對中風型自發性高血壓大鼠 (stroke-prone spontaneously hypertension rats，SHRsp) 中風後血壓、存活時間、平均壽命、神經症狀及腦係數的影響。將SHRsp隨機分為：SAB低 (0.10 g/kg) 、中 (0.20 g/kg) 、高 (0.40 g/kg) 劑量組、華佗再造丸 (廣州奇星藥業有限公司製造，用於痰瘀阻絡之中風恢復期和後遺症) 組和病理模型組。正常組每組10隻Sprague–Dawley大鼠，連續給藥20天，觀察SAB對SHRsp中風後血壓、神經狀態變化、死亡率、腦係數及對海馬區神經元的影響。
結果SAB與華佗再造丸皆能降低SHRsp血壓，改善SHRsp腦中風後的神經症狀，延長中風後存活時間，降低腦係數，降低腦中風後大鼠死亡率，保護海馬區神經元。因此，王麗君等人推論懷牛膝總皂苷對實驗性SHRsp腦中風具有改善的作用 [19]。
韋相蘭等人以自製改良的Feeney法製備重型顱腦損傷大鼠模型。研究觀察了懷牛膝 (Achyranthes bidentata Blume) 對重型顱腦損傷大鼠腦組織巢蛋白 (nestin) 表現的影響，並將大鼠分為：懷牛膝低、中、高劑量組、模型組、與假手術組。給藥7日後取各組大鼠腦組織，用蘇木素-伊紅 (hematoxylin and eosin，H&E) 染色觀察腦組織損傷灶之病理變化，並以免疫組織化學法檢測大鼠腦組織損傷灶nestin的表現情形。
結果發現懷牛膝高劑量組nestin的表現量顯著高於模型組 (P<0.05) ，而懷牛膝中劑量組、低劑量組與模型組比較則無明顯差異；假手術組僅在海馬區可見極少量的細胞有nestin表現，其它部分則無表現。綜上實驗結果顯示，韋相蘭等人推論高劑量懷牛膝能增加重型顱腦損傷大鼠腦組織nestin的表現量，可能對重型顱腦損傷大鼠神經幹細胞的再生具有促進作用 [20]。
2. 增加骨質密度：
Zhang等人研究了懷牛膝根部萃取物 (Achyranthes bidentata root extract，ABRE) 對停經後骨質疏鬆症 (postmenopausal osteoporosis) 的影響。研究將80隻3個月大的雌性Sprague–Dawley大鼠隨機分為：假手術組 (sham-operated group，SHAM) 與卵巢摘除 (ovariectomy，OVX) 組，而OVX組再分為5小組：OVX空白對照組、17β-ethinylestradiol (E2，25 μg/kg/day) 組、100 mg/kg/day ABRE、300 mg/kg/day ABRE及500 mg/kg/day ABRE組。卵巢摘除後第4週開始每日給予大鼠口服E2或ABRE，連續16週後以雙能量X光吸收儀 (dual-energy X-ray absorptiometry，DEXA) 、血清及尿液中生化指數、三點彎曲試驗 (three-point bending test) 檢測大鼠骨質量、骨代謝轉換與骨強度。
結果ABRE組大鼠體重增加趨緩，並能藉由降低血清鹼性磷酸酶 (alkaline phosphatase，ALP) 、骨鈣素 (osteocalcin，OC) 及尿液去氧比林二酚胺 (deoxypyridinoline，DPD) 的濃度及鈣的排泄，改變骨重塑速率，而達到防止因卵巢摘除所致骨質流失的效果，同時也增加了骨強度、減緩了骨小樑微細結構 (trabecular microarchitecture) 之惡化。
綜上所述實驗結果，Zhang等人推論ABRE能藉由調控OVX大鼠骨礦物密度 (bone mineral density，BMD) 、維持骨小樑微細結構而能改善骨生物力學品質，且對子宮無增生性作用 (hyperplastic effect) ，可能具有應用發展於治療停經後骨質疏鬆症的潛力 [21]。
3. 保護軟骨：
中藥川牛膝 (Cyathula officinalis Kuan) 常應用於治療發炎性疾病，因此Park等人欲探究川牛膝對關節炎病程中，軟骨膠原基質 (cartilage collagen matrix) 降解 (degradation) 之重要酵素──基質金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinase，MMP) -13的抑制作用。
實驗結果發現50至200 µg/ml川牛膝乙醇萃取物、正己烷與氯仿可溶性分離部分能抑制IL-1β所致人類骨肉瘤SW1353細胞MMP-13活化，而依據活性可分離出6種不同的化合物：palmitic acid (1)、β-sitosterol (2)、α-spinasterol (3)、atractylenolide I (4)、1,3-diacetoxy-tetradeca-6E,12E-dien-8,10-dyn (5)與N-trans-feruloyl-3-methyldopamine (6)。其中4與5具有抑制IL-1β誘發SW1353細胞MMP-13活性的作用，而小鼠口服4 (20-200 mg/kg) 對於λ-鹿角菜膠 (carageenan) 所致小鼠的掌爪水腫具有抗水腫活性。Park等人由上述實驗結果闡明了川牛膝的抗發炎機制，而推論出川牛膝及其成份對於軟骨保護及其退化性疾病可能具有相當程度的應用潛力 [22]。
4. 免疫調節作用：
過去研究發現植物多醣為一種免疫調節劑 (immunomodulators) ，與先天性及後天適應性 (innate and adaptive immune systems) 免疫系統常有許多交互作用；活化的樹狀細胞 (dendritic cells，DCs) 能促進癌症病患的抗腫瘤作用，而植物多醣常為誘導DCs活化的天然免疫佐劑 (adjuvants)。
因此Zou等人研究探討了懷牛膝多醣 (polysaccharide isolated from Achyranthes bidentata，ABP) 對鼠DCs表現型及功能性成熟 (phenotypic and functional maturation) 的調控狀況。研究使用傳統掃描式電子顯微鏡 (scanning electronic microscopy，SEM) 觀察DC表現型成熟及功能性成熟的形態，穿透式電子顯微鏡 (transmitted electron microscopy，TEM) 則觀察DC內溶酶體 (lysosomes) 的形態，免疫組織化學分析DCs的吞噬作用，流式細胞儀 (flow cytometry，FCM) 檢測DCs表面主要分子的變化，生物酵素分析法檢測酸性磷酸酶 (acidic phosphatases，ACP) 的活性，以及酶連免疫吸附法 (enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA) 分析發炎前趨細胞激素IL-12的生成情形。
實驗結果發現ABP能增加DCs表面CD86、CD40以及MHC II等分子的表現，誘導DCs表現型成熟，並能降低DCs內ACP的活性 (這通常發生於抗原呈現增加，吞噬作用減少時) 。此外，ABP尚能促進DCs增加IL-12的生成。Zou等人由上述實驗結果推測ABP能有效調控並促進鼠DCs的活化，其類佐劑的活性應用於促進免疫反應，具有臨床發展的可能性 [23]。
參考文獻
1. 童承福，台灣市售易誤用、混用中藥品種之現況，行政院衛生署中醫藥委員會中醫藥資訊網醫藥知識區/常誤用藥材。
2. 財團法人台灣必安研究所，誤/混用藥材報告 ─ 牛膝，財團法人台灣必安研究所網站文章專區>中醫藥常識>誤混用藥材，2009年08月21日。
3. 劉月香、楊榮季，台灣易混淆藥材－牛膝類的介紹，藥學雜誌電子報，臨床生藥學，99期，民國98年6月30日。
4. 國家中醫藥管理局中華本草編委會，中華本草精選本上冊，上海，上海科學技術出版社，402，1998。
5. 崔瑛、侯士良，懷牛膝預防動脈粥樣硬化的實驗研究，基層中藥雜誌，12:30- 31，1998。
6. Li, J.X., Hareyama, T., Tezuka, Y., Zhang, Y., Miyahara, T., Kadota, S. Five new oleanolic acid glycosides from Achyranthes bidentata with inhibitory activity on osteoclast formation. Planta Med., 71:673-679, 2005.
7. He, C.C., Hui, R.R., Tezuka, Y., Kadota, S., Li, J.X. Osteoprotective effect of extract from Achyranthes bidentata in ovariectomized rats. J. Ethnopharmacol., 127:229-234, 2010.
8. Han, S.B., Lee, C.W., Yoon, Y.D., Lee, J.H., Kang, J.S., Lee, K.H., Yoon, W.K., Lee, K., Park, S.K., Kim, H.M. Prevention of arthritic inflammation using an oriental herbal combination BDX-1 isolated from Achyranthes bidentata and Atractylodes japonica. Arch. Pharm. Res., 28:902-908, 2005.
9. Sun, H.X. Adjuvant effect of Achyranthes bidentata saponins on specific antibody and cellular response to ovalbumin in mice. Vaccine, 24:3432-3439, 2006.
10. Jin, L.Q., Zheng, Z.J., Peng, Y., Li, W.X., Chen, X.M., Lu, J.X. Opposite effects on tumor growth depending on dose of Achyranthes bidentata polysaccharides in C57BL/6 mice. Int. Immunopharmacol., 7:568-577, 2007.
11. Ding, F., Cheng, Q., Gu, X. The repair effects of Achyranthes bidentata extract on the crushed common peroneal nerve of rabbits. Fitoterapia, 79:161-167, 2008.
12. Shen, H., Yuan, Y., Ding, F., Liu, J., Gu, X. The protective effects of Achyranthes bidentata polypeptides against NMDA-induced cell apoptosis in cultured hippocampal neurons through differential modulation of NR2A- and NR2B-containing NMDA receptors. Brain Res. Bull., 77:274-281, 2008.
13. Zhou, S., Chen, X., Gu, X., Ding, F. Achyranthes bidentata Blume extract protects cultured hippocampal neurons against glutamate-induced neurotoxicity. J. Ethnopharmacol., 122:547-554, 2009.
14. Yuan, Y., Shen, H., Yao, J., Hu, N., Ding, F., Gu, X. The protective effects of Achyranthes bidentata polypeptides in an experimental model of mouse sciatic nerve crush injury. Brain Res. Bull., 81:25-32, 2010.
15. Shen, H., Yuan, Y., Ding, F., Hu, N., Liu, J., Gu, X. Achyranthes bidentata polypeptides confer neuroprotection through inhibition of reactive oxygen species production, Bax expression, and mitochondrial dysfunction induced by overstimulation of N-methyl-D-aspartate receptors. J. Neurosci. Res., 88:669-676, 2010.
16. 彭宗根、陳鴻珊、郭志敏、董飚、田庚元、王光強，牛膝多糖硫酸酯體外和體內抗艾滋病病毒作用，藥學學報，43:702-706。
17. Chen, Q., Liu, Z., He, J.H. Achyranthes bidentata polysaccharide enhances immune response in weaned piglets. Immunopharmacol. Immunotoxicol., 31:253-260, 2009.
18. Shen, Y., Zhang, Q., Gao, X., Ding, F. An active fraction of Achyranthes bidentata polypeptides prevents apoptosis induced by serum deprivation in SH-SY5Y cells through activation of PI3K/Akt/Gsk3β pathways. Neurochem. Res.,in press, 2011.
19. 王麗君、朱焰、廖矛川，牛膝總皂苷對卒中型自發性高血壓大鼠的影響，中國中藥雜志，36:1239-1241，2011。
20. 韋相蘭、黃李平、李凱、劉啟華，懷牛膝對重型顱腦損傷大鼠腦組織Nestin表達的影響，四川中醫，29:59-61，2011。
21. Zhang, R., Hu, S.J., Li, C., Zhang, F., Gan, H.Q., Mei, Q.B. Achyranthes bidentata root extract prevent OVX-induced osteoporosis in rats. J. Ethnopharmacol., in press, 2011.
22. Park, H.Y., Lim, H., Kim, H.P., Kwon, Y.S. Downregulation of matrix metalloproteinase-13 by the root extract of Cyathula officinalis Kuan and its constituents in IL-1β-treated chondrocytes. Planta Med., 77:1528-1530, 2011.
23. Zou, Y., Meng, J., Chen, W., Liu, J., Li, X., Li, W., Lu, C., Shan, F. Modulation of phenotypic and functional maturation of murine dendritic cells (DCs) by purified Achyranthes bidentata polysaccharide (ABP). Int. Immunopharmacol., 11:1103-1108, 2011.
